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單克隆抗體簡介

單抗與多抗的區別抗體是指能與相應抗原特異結合的具有免疫活性的球蛋白。常規的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產生的,因而抗血清通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇,所以常規抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規血清抗體,仍是由不同B細胞克隆產生的異質的抗體組成。因而,常規血清抗體又稱多克隆抗體(polyclonal antibody),簡稱多抗。
而單克隆抗體(monoclonal antibody)則是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤(hybridoma)技術來制備——雜交瘤抗體技術是在細胞融合技術的基礎上,將具有分泌特異性抗體能力的B細胞和具有無限生長能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征,既像骨髓瘤細胞一樣在體外培養中能無限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴細胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系,即雜交瘤細胞系,它所產生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質的抗體,即單抗。
與多抗相比,單克隆抗體具有純度高,專一性強、重復性好、且能持續地無限量供應等優點。單克隆抗體技術的問世,不僅帶來了免疫學領域里的一次革命,而且它在生物醫學科學的各個領域獲得極廣泛的應用,促進了眾多學科的發展。(單抗與多抗的區別

單克隆抗體結構

抗體是具有4條多肽鏈的對稱結構,形狀類似于“Y”的結構,分子量約150kDa。Ig分子的結構包括兩個二硫鍵連接的兩半相同的糖蛋白,由兩條相同的50kDa的重鏈(Height Chain)和25kDa的輕鏈(Light Chain)組成,通過在輕鏈羧基末端附近的二硫鍵連接在一起。輕鏈有κ和λ兩種,重鏈有α、δ、γ、ε和μ五種。
單克隆抗體結構圖

IgDPart of the B cell receptor。Activates basophils and mast cells。

Name Properties
IgA Found in mucous,saliva,tears,and breast milk。Protects against pathogens。
IgE Protects against parasitic worms。Responsible for allergic reactions。
IgG Secreted by palsma cells in ther blood。Able to cross the placenta into the fetus。
IgM May be attached to the surface of a B cell or secreted into the blood。Responsible for early stages of immunity

一個抗體分子上的兩個抗原結合部位是相同的,位于兩臂末端稱抗原結合片段(antigen-binding fragment, Fab)。”Y”的柄部稱結晶片段(crystalline fragment, FC),糖結合在FC 上。整個抗體分子可分為恒定區(C區)和可變區(V區)兩部分。在給定的物種中,不同抗體分子的恒定區都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列。可變區位于“Y”的兩臂末端。在可變區內有一小部分氨基酸殘基變化特別強烈,這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發生變異區域稱高變區(hypervariable region,HVR)。高變區位于分子表面,最多由17個氨基酸殘基構成,少則只有2~3個。高變區氨基酸序列決定了該抗體結合抗原抗原的特異性。碳水化合物連接到抗體分子的Fc端,Fc區含有所有的免疫球蛋白共有的蛋白質序列及各個類別獨有的決定簇,且在相同類別的不同Ig分子上沒有顯著變化,所以Fc端稱為恒定區。

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單克隆抗體的作用機制

mAb的生物學功能主要是由其結構決定。抗體由抗原結合域(Fab)和結晶區域(Fc)組成,Fab主要特異性識別腫瘤相關抗原,進而調控下游的信號通路。Fc可以識別并結合表達Fc受體的免疫細胞以及血液中的補體進而介導抗體依賴的細胞毒作用(ADCC), 抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)以及補體依賴的細胞毒作用(CDC)等效應功能,Fc還可以結合新生IgG轉運受體(FcRn)從而在體內不被輕易清除而延長了其在機體內的半衰期。在這里根據抗體的結構,我們將其作用機制分為Fab相關的作用機制和Fc相關作用機制。

Fab相關的作用機制

1)識別游離的靶點
游離于血液循環中的細胞因子、促血管生成因子、生物毒素等都可以作為單抗的作用的靶點。蛋白因子通過與受體的結合,傳導信號進入細胞,調控細胞的功能。過量表達的蛋白因子傳導過量的信號,打破細胞的正常功能。毒素和病毒等也必須通過與細胞表面的受體結合進入細胞內部從而發揮作用。中和抗體的作用機制就是通過結合抗原進行中和,使抗原喪失結合受體的能力,進而喪失生物學功能。常見的針對游離靶點的抗體有血管內皮生長因子(VEGF)抗體,腫瘤壞死因子(TNF)抗體,炭疽毒素中和抗體等。

2)識別細胞表面受體

Fab的作用機制識別細胞表面受體的單克隆抗體的作用機制(Fab dependent)

每一種抗體都可以特異性結合特定的抗原靶點。靶點抗原表達在細胞表面,具有特定的功能,例如細胞激活、生長或遷移等。根據Fab活性,可以分為結合、拮抗和激活三種類型。結合型抗體只是結合在靶蛋白表面但并不影響其功能。因此,靶蛋白受體的配體仍然可以與其結合,從而傳遞信號。結合性抗體可以用于標記靶細胞,從而讓其Fc產生效應功能或通過搭載毒素來殺滅靶細胞。拮抗性抗體封阻受體上的與配體相互作用所需的表位,阻止配體結合產生的信號傳導。激活型抗體能夠模擬配體的功能,識別結合靶受體并傳導信號至細胞內部。基于被激活的細胞內信號強弱,激活型抗體可能在治療時使得靶細胞被激活并釋放細胞因子,進而產生副作用。

Fc相關的作用機制

單克隆抗體通過其Fc部位結合各種FcγRs,進而發揮其效應功能,包括ADCC, ADCP和CDC。以最常見的IgG1為例,其Fc區域通過結合FcγRIII(CD16A)激活NK細胞誘導ADCC;與巨噬細胞上FcγRIII(CD16A),FcγRII(CD32A)和FcγRI(CD64)結合,引發ADCP;與補體的C1q結合激活補體引發CDC。Fc還能夠以pH依賴的方式結合FcRn,避免被核內體降解,從而延長單克隆抗體的半衰期。

Fc的作用機制單克隆抗體(IgG1)作用機制(Fc dependent)

1)抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)
ADCC作用是一種細胞介導的免疫防御機制,在靶細胞膜表面抗原結合了特異性的抗體的情況下,激活免疫系統的效應細胞進而裂解靶細胞的作用。因其對已存在的抗體的依賴性,ADCC作用是適應性免疫反應的一部分,也是體液免疫反應的一部分,用于限制和消除感染。經典的ADCC作用通常由NK細胞介導,但巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞也能介導ADCC作用。比如嗜酸性粒細胞能通過ADCC作用殺死某些特定的寄生蟲。
體外檢測ADCC效應有幾種方法,一種是標記靶細胞的方法:比如用51Cr或具有膜通透性的甲基酯熒光染料,比如calcein-AM或DELFIA-BATDA。靶細胞標記后,加入抗體孵育,然后再加入NK92/CD16A細胞或者從PBMC純化的NK92,或者PBMC作為效應細胞,不同的效應細胞和靶細胞的比例,不同的孵育時間(通常低于4小時,更長的孵育時間也是可以的,只是自發釋放會相應變大)。孵育結束后,加入enhancing solution,用不同的儀器檢測放射性同位素和熒光染料,這些方法相對可信但靈敏度不夠。其他一些方法,例如檢測乳酸脫氫酶(LDH)的釋放,這個方法的缺點是由于靶細胞沒有被標記,不能區分效應細胞和靶細胞的釋放,所以也沒有被頻繁使用。最有吸引力的檢測ADCC效應的方法是基于流式細胞術法(FACS)檢測,這種方法通常需要標記靶細胞,或者同時標記靶細胞和效應細胞,然后檢測靶細胞的活細胞的減少量,然而這種方法相對比較復雜,因為FACS檢測時出現至少兩群細胞(包括靶細胞和效應細胞),這需要染雙色或者三色。相比較其他,用FACS方法檢測ADCC相對可靠,最終結果需要一個獨立的方法來驗證。無論使用哪種方法,效應細胞通常是PBMC或純化的NK細胞。效應細胞需要用IL-2預活化過夜以增強效應細胞的活性,但由于個體的差異,以及FcRγIIIA多態性的原因,導致同一個抗體的每次ADCC實驗數據差距很大,可重復性差,而使用NK細胞系穩轉CD16A,使體外ADCC實驗變得更穩定,可重復性強。
2)抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)
眾多小鼠體內實驗表明,IgG1的治療性抗體作用與巨噬細胞及其表達的FcγRs尤其是FcγRIV高度依賴,這些細胞不會引發高效的ADCC效應但是會引發ADCP效應,所以了解ADCP的作用機制也是很有必要的。
測定抗體的ADCP與ADCC類似,都取決于共孵育的兩種細胞:適應的靶細胞加入到效應細胞中(巨噬細胞或中性粒細胞),共孵育1-2小時,有時候也需要更長的孵育時間。效應細胞通常是從外周血單核細胞(PBMC)通過免疫親和方法富集或純化而來。然后在血清或生長因子例如GM-CSF和/或M-CSF存在下,將它們體外分化4-7天。因此,效應細胞可以廣泛變化,不僅是由于供體關聯的FcγRs多態性,而且還由于單核細胞來源,純化程序,分化成巨噬細胞的時間和條件等。
抗體依賴的細胞吞噬作用

3)補體依賴的細胞毒作用(CDC)
補體是存在于血清與組織液中一組不耐熱的,經活化后具有酶活性的蛋白質。抗體的Fc片段能夠結合血清補體分子(C1q),繼而形成膜攻擊復合物(MAC)清除目的細胞。補體的激活過程是個級聯過程。首先是識別階段:抗原與抗體結合后,C1q能識別抗體上的補體結合點,并與之結合。由于C1q的構型發生改變,可激活C1r和C1s;在Ca2存在下,形成具有酶活性的C1s。接著是活化階段C1s將C4分解成小碎片的C4a和大碎片的C4b,C4b可與細胞膜結合;C1s激活C4后,再激活C2(分解成C2a和C2b);補體依賴的細胞毒作用C2b與C4b結合,形成有酶活性的C4b2b(C3轉化酶)。C3被C4b2b裂解在C3a和C3b兩個片段,C3b與C4b2b相結合產生的C4b2b3b為經典途徑的C5轉化酶。最后為攻膜階段C5在C4b2a3b的作用下裂解為C5a和C5b,C5b與細胞膜和C6、C7結合,形成C5b67復合物,進而與C8、C9分子聯結成C5b6789復合體,即為攻膜復合體,造成細胞膜溶解。
雖然許多治療性抗體恒定區都是人的IgG1的Fc,但它們激活補體的能力卻有極大的不同。激活補體不僅需要靶細胞表面表達較高密度的抗原,也需要抗體分子的高特異靶向性,高靶向性才能結合多個C1q并且有效激活補體。另外,位于細胞表面或者一些游離的補體抑制劑能夠有效阻斷補體級聯反應。腫瘤細胞在其細胞表面經常高表達一些補體抑制劑如CD46,CD55和CD59,這些分子能夠保護靶細胞免受補體介導的殺傷作用。因此,基于以上這些多因素的存在,導致許多IgG1的抗體只具有非常弱的CD作用。

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