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熱啟動Taq酶的原理與應用

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聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外合成雙鏈DNA的一種方法,其原理類似于天然DNA的復制過程,其特異性主要依賴于與其目的片段兩段互補的特異引物。典型的PCR反應有三個步驟:變性,退火,延伸,經過多次循環反應,獲得目的片段。

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熱啟動Taq酶的原理

在PCR的發展歷史中,熱啟動酶的探索發現是制約PCR發展的重要因素,最初被運用到PCR中的酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段,Klenow酶每次循環都需重新加入,過程繁瑣。此后,科學家成功的從水生嗜熱桿菌中提取出耐熱的DNA聚合酶,該酶在90℃下反應2小時仍具有70%的活性,這就避免每次循環重新加酶的過程,提高了擴增效率,因此被廣泛運用到PCR擴增中。

溫度對酶活性的影響表現為雙重作用,高溫失活,低溫抑制。普通的Taq DNA聚合酶的最適溫度是72℃,此時酶的活性最佳,小于此溫度,酶有較弱活性。這樣,在PCR擴增由低溫上升至高溫的過程中(也就是溫度達到變性溫度時)酶發揮較弱的活性,體系極易錯配或形成引物二聚體,尤其是當設計的引物3’端是G或C,錯配的鏈很難重新解開。因此要提高PCR擴增的特異性和降低反應錯配率,可以人為的控制酶的活性,在72℃之前讓酶不發揮活性,這樣就避免了在升溫過程中(或配置反應體系)發生鏈的錯配,從而保證擴增的特異性。Relia熱啟動酶就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心:低溫下化學小分子和酶活性中心結合,酶無活性,溫度升高至95℃,兩者脫離,酶活性中心暴露,開始指導體系擴增(如圖一),極大的提高擴增的特異性和靈敏度。與抗體封閉的酶相比,化學修飾的酶活性維持更加穩定(抗體封閉是一種動態平衡)且無任何外源DNA污染。

熱啟動Taq酶原理
圖一:熱啟動原理

熱啟動Taq酶的應用

PCR能夠快速特異的擴增任何已知的DNA片段,因此被廣泛的應用于分子生物學的各個領域。Relia熱啟動酶因具有5’-3’核酸外切酶活性,可用于熒光定量PCR反應。采用熱啟動法擴增是提高PCR特異性的常用方法,熱啟動酶是很好的選擇。除此之外,因其具有的高特異性高靈敏度被廣泛應用到各個方面:構建cDNA文庫,產生大量DNA測序,突變體分的析構建,基因分離,遺傳病診斷,法醫鑒定等。

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