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多聚組氨酸標簽(His-tag)介紹及親和層析原理

相關資料:His標簽親和純化實驗步驟(詳細)

本文描述了多聚組氨酸標簽(His-Tag)融合蛋白使用Ni-IDA/Ni-NTA進行親和層析的基本原理,優勢,以及實驗操作流程。

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固定化金屬離子親合層析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),簡稱金屬螯合親合層析,是一種新型的應用于原核蛋白純化的技術。該方法通過蛋白質表面的一些特殊的氨基酸,使之與金屬離子發生相互作用,從而對蛋白質進行親和純化。這些作用包括配價鍵結合、靜電吸附、共價鍵結合等,其中以6個組氨酸殘基組合的融合標簽(His-Tag)在原核蛋白表達中的應用最為顯著。

His-Tag可結合在目的蛋白的C末端或N末端,形成特殊的結構,以便于進行下一步的純化及檢測。由于金屬螯合親合層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點,所以可選擇范圍廣,高鹽,存在變性劑以及去垢劑的上樣條件下進行純化,His-Tag正逐漸成為分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一。

His-tag作為蛋白純化時的首選標簽,其優勢在于:

  1. N-端的His-Tag與細菌的轉錄翻譯機制兼容,有利于蛋白表達;
  2. 采用IMAC(固定化金屬離子親合層析)純化His-Tag融合蛋白操作更加簡便;
  3. His-Tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響,不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學功能;
  4. His-Tag非常小,在融合蛋白結晶后對蛋白的結構沒有影響;His-Tag的免疫原性相對較低,可將純化的蛋白直接注射入動物體內進行免疫并制備抗體;
  5. 與其它親和標簽構建成雙親和標簽,并可應用于多種表達系統;

His-Tag融合蛋白的適用范圍也較廣,既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化,也可以在變性條件下進行純化。前者通常用來純化疏水性強的目的蛋白,而后者則通常純化包涵體蛋白。

His-Tag親和層析填料

His-Tag可與多種金屬離子發生特殊的相互作用,如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其原理是利用蛋白質表面的特性,使之被吸附在凝膠柱上,從而達到分離純化蛋白的目的。

Ni2+在親和純化實驗中的使用最為廣泛。根據結合基團的不同,Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六個螯合價位,其中Ni-IDA螯合了三價,Ni-NTA螯合了四價。所以IDA的載量要比NTA的高,在同樣條件下Ni-IDA洗脫時的咪唑濃度也高于Ni-NTA。但其弱的結合力使金屬離子在洗脫階段時很容易浸出,與目的蛋白緊密結合,從而導致分離蛋白產量偏低,產品不純及金屬離子污染等問題。而NTA的顆粒粒度均勻,粒徑更小,并且螯合鎳更穩定,能耐受較高的還原劑,使填料更加穩定,鎳離子不易脫落。

Ni-IDA和Ni-NTA結構圖

IMAC在通常的情況下是比較穩定的,但螯合劑的存在則會導致其金屬離子脫落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑,如在三羧酸循環中產生了二羧酸類物質。因此,E.coli在某些高壓情況下就會產生高特異性的金屬螯合劑(通常存在于細菌的細胞周質中),導致His-Tag融合蛋白純化的純度和產量大大降低。所以在進行純化His-Tag融合蛋白的實驗時,首先需要去除螯合劑。

Ni-NTA親和層析實驗

Ni-NTA分離帶His標簽的重組蛋白

  1. Ni-NTA裝柱,1.6×20cm,柱床體積為10ml;
  2. 用緩沖液1平衡2~5個床體積,流速為2ml/min;
  3. 將20ml細胞破碎液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45um濾膜過濾,上樣,流速為1ml/min;
  4. 用緩沖液1再洗2~5個床體積,流速為2ml/min;
  5. 用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進行階段洗脫,流速為2ml/min,收集各階段洗脫峰,用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度;
  6. 用純水流洗5個柱床體積,再用20%的乙醇流洗3個柱床體積,流速為2ml/min,柱子置于低溫環境中保存。

緩沖液組成:

緩沖液1

50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g,
加適量水溶解后定容到1000ml。

緩沖液2

50mM磷酸鹽緩沖液,pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g和咪唑34g, 加適量,水調pH后定容到1000ml。

緩沖液3

不同咪唑濃度的緩沖液B配制:

咪唑濃度 緩沖液1量(ml) 緩沖液2量(ml)
10mM 98 2
50mM 90 10
100mM 80 20
200mM 60 40
300mM 40 60
400mM 20 80

咪唑洗脫原理

Ni柱中的氯化鎳可以與有His-Tag的融合蛋白結合,也可以與咪唑進行結合,當標簽蛋白與層析柱表面珠孔內的
鎳離子介質發生結合時,不同濃度的咪唑通過層析柱,就會將與鎳配位的標簽蛋白,雜蛋白等分別洗脫下來,從而得到高純度目標蛋白。

附錄:Ni-IDA和Ni-NTA的一些參數對比

名稱 Ni-IDA Ni-NTA
參數 指標
基質 6%交聯瓊脂糖凝膠
配基 亞胺二乙酸(IDA) 次氮基三乙酸(NTA)
粒徑 45~165 μm 60~169 μm
金屬離子密度 40 μmol/ml 20-40 μmol/ml
載量 25-30mg蛋白/ml 15mg蛋白/ml
柱體積 1ml或5ml 1ml或5ml
柱尺寸
(內徑x高度)
0.9×1.57cm(1ml柱子)
0.9×1.57cm(5ml柱子)
0.6cmx2.8cm(1ml柱子)
1.4cmx2.98cm(5ml柱子)
推薦流速 1ml/min(1ml柱子)
5ml/min(5ml柱子)
最高流速 4ml/min(1ml柱子)
10ml/min(1ml柱子)
20ml/min(5ml柱子)
40ml/min(5ml柱子)
最高耐壓 0.3MPa(3bar) 0.5MPa(5bar)
避免使用的試劑 螯合劑:EDTA、EGTA、檸檬酸等 >20mM硫化試劑
>10mM DTT
螯合劑:EDTA、EGTA
陰離子去污劑
pH穩定性 PH 2-14(短期,2h);PH 3-12(長期,7天)
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