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蛋白純化標簽選擇

下載
體外重組蛋白表達技術已經滲透到生物學的各個領域。目前,體外重組蛋白表達系統主要有四類:原核表達系統、哺乳動物細胞表達、酵母表達系統及昆蟲細胞表達。表達的一般實驗包括載體構建-表達鑒定-蛋白純化三大步驟。在構建載體階段,除了一些必要的表達元件,還需要考慮的密碼子優化和標簽的選擇。選擇合適的標簽不但有利于蛋白的純化,促進蛋白的可溶性,同時也不能影響蛋白的結構功能和下游應用。本文詳細介紹了幾種蛋白純化標簽,幫助我們更好的設計實驗。

蛋白純化標簽比較

融合標簽 大小(KD) 功能 是否切除
HIS 0.84 有利純化,能純化可溶性/包涵體蛋白 標簽小,對蛋白無影響
GST 26 增強蛋白可溶性,僅能純化可溶性蛋白,屏蔽毒性蛋白 標簽較大,影響較大
MBP 44.4 增強蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白
NusA 55 增強蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白
SUMO 11.2 增強可溶性,屏蔽毒性蛋白

表1:各個標簽性能對比表

HIS-Tag(組氨酸標簽)

HIS-Tag蛋白純化的首選標簽

  • HIS-Tag本身的特性對目的蛋白沒有影響,不會形成二聚體;
  • 分子量較小,只有0.84KD,對蛋白的下游應用不會產生影響;
  • 免疫原性低,可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫并制備抗體;
  • HIS-Tag與細菌的轉錄翻譯機制兼容,有利于蛋白表達;
  • 可與其他標簽構建雙標簽表達,可用于多種蛋白表達系統,純化條件溫和對蛋白影響較小。

his標簽信息
HIS-Tag由6-10個組氨酸殘基組成,分子量不到0.84KD,,通常插入在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表達最常用的標簽,蛋白純化完之后可以不需切除此標簽,也不會對蛋白產生功能影響。同時,蛋白純化步驟簡便,純化條件溫和,對蛋白也不會產生太大影響。

GST-Tag(谷胱甘肽巰基轉移酶標簽)

GST-Tag相對分子質量較大,約為26KD,插入在目的蛋白的C末端或N末端,大腸桿菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶。一般選擇GST標簽的目的有兩個,一是提高蛋白表達的可溶性,二是提高蛋白的表達量。蛋白表達純化結束后需根據不同的蛋白應用而確定是否切除標簽,標簽較大,切除與否需根據下游應用考慮。如果要去除GST融合部分,可用位點特異性蛋白酶切除。檢測方法可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。
GST的序列:
GST序列

GST-Tag的優缺點

  • 增加外源蛋白的可溶性;
  • 可在不同的宿主中表達,適用范圍廣;
  • 可用不同的蛋白酶可以方便去除;
  • 很好保留了蛋白的抗原性和生物活性,提高外原蛋白的穩定性;
  • 高特異性,純化方便且溫和;
  • 分子量較大,可能會影響蛋白質的功能和下游實驗;
  • 如果蛋白不可溶,很難用變性的方法純化。

GST親和純化原理

GST 親和層析是利用GST 融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價親和,通過GSH交換洗脫的原理來進行純化 。該純化柱中,凝膠手臂上通過硫鍵結合一個谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉移酶(即GST-tag(26 KDa))之間酶和底物的特異性作用力,使得帶GST標簽的融合蛋白能夠與凝膠上的手臂谷胱甘肽結合,從而將帶標簽的蛋白與其他蛋白分離開。谷胱甘肽通常有氧化型GSSG和還原型GSH,當我們使用GSH洗脫時,GSH會與凝膠上的谷胱甘肽競爭結合融合蛋白,從而將目標蛋白洗脫。

GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione?sepharose)親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力,因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如:鹽酸胍或尿素等。如果蛋白表達在包涵體中,可復性后再純化。此外要去除GST標簽,可用位點特異性蛋白酶切除。

GST蛋白純化流程圖:
GST蛋白純化流程

MBP-Tag(麥芽糖結合蛋白標簽)

MBP(麥芽糖結合蛋白maltose binding protein), 殘基數346,分子量42.5KDa,由大腸桿菌K12的malE基因編碼,構建時刻放在N端,用來提高可溶性(尤其是真核蛋白)。MBP的折疊需要DnaK-DnaJ-GrpE和
GroEL-GeoES兩個分子伴侶系統的幫助,這可以使這些分子伴侶聚集到目的蛋白的附近幫助其正確折疊。另外,以標簽蛋白形式存在的麥芽糖結合蛋白可以減少目的蛋白的降解,提高表達產物的水溶性,也為以后對目的蛋白的純化提供了基礎。麥芽糖結合蛋白能夠被多糖樹脂吸附,因此在過柱時,能夠使融合蛋白與其它蛋白成份分離。
MBP氨基酸序列:

MBP標簽的優缺點

  • 簡單親和純化即可實現;
  • 增加蛋白表達量和蛋白穩定性;
  • 促進蛋白的可溶性和正確折疊;
  • 標簽較大,對蛋白的結構/功能會有一定影響。

NusA-Tag(轉錄終止/抗終止蛋白標簽)

NusA是大腸桿菌自身的一種蛋白,即轉錄抗終止因子,殘基數,495,分子量:54.87KDa,由1999年Davia將NusA從4000種大腸桿菌蛋白庫中篩得。NusA不具有獨立的純化標簽功能,所以要與其它標簽(如His標簽)聯用。利用原核表達時,NusA標簽可以明顯的提高蛋白的可溶性,例如含有NusA標簽的人白介素-3 融合蛋白(NusA/hIL-3 )在37℃條件下誘導表達幾乎全部可溶(97%),而當其單獨表達或融合GST標簽表達時都是包涵體形式。另外NusA標簽還可以提高不溶性靶蛋白如牛生長激素(bGH)、人干擾素-γ (hIFN-γ)的可溶性。來自草木犀根瘤菌(Rizobiummeliloti)的酪氨酸激酶因為分子量大(超過54kDa)并且基因含有大量稀有密碼子,自身在大腸桿菌中無法過量表達,但是與NusA融合后卻可以高效表達。
NusA氨基酸序列:
NusA序列

NusA的優缺點

  • 可以提高蛋白質的溶解性,可選的標簽有NusA,MBP,GST;
  • 這些標簽不能用專門的親和基質純化,融合蛋白構建時必須與可用于純化的小親和標簽連用。尤其是當NusA蛋白增加融合蛋白溶解性時,一些在大腸桿菌中表達為不溶性的蛋白在與NusA在N端融合時則變成可溶。但是由于它的分子量較大,導致靶蛋白的得率相對降低;
  • NusA本身不具有獨立的純化標簽功能,所以要與其它標簽如His標簽聯用;
  • NusA對蛋白下游應用會有影響,如蛋白需進行結構分析(晶體衍射或核磁共振)。

SUMO(小泛素相關修飾物)

SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素相關修飾蛋白,是存在于真核生物中高度保守的參與蛋白質小泛素化相關修飾的一類大蛋白。與GST、MBP或NusA相比,SUMO不僅可以作為重組蛋白表達的融合標簽還具備分子伴侶的功能,能促進蛋白的正確折疊,對熱和蛋白酶具有耐受性,更有助于保持目的蛋白的穩定性。此外,SUMO標簽有著與其配套的蛋白酶(專一性強),此蛋白酶識別的是SUMO的三級結構,切割的特異性極高,不存在任何氨基酸的殘留,因此適用于重組蛋白表達。

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